多糖類
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多糖類(polysaccharide) 是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，廣泛存在于高等植物、動(dòng)物、微生物、地衣和海藻等中，如植物的種子、莖和葉組織、動(dòng)物粘液、昆蟲及甲殼動(dòng)物的殼真菌、細(xì)菌的胞內(nèi)胞外等。多糖在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫促進(jìn)等方面發(fā)揮著生物活性作用。具有免疫活性的多糖其衍生物常常還具有其它的活性, 如硫酸化多糖具有抗HIV活性及抗凝血活性, 羧甲基化多糖具有抗腫瘤活性。因此對(duì)多糖的研究與開發(fā)已越來越引起人們的廣泛關(guān)注。 目前，多糖類新藥的申報(bào)出現(xiàn)日漸增多的趨勢(shì)。因此，探討多糖類新藥的藥學(xué)研究評(píng)價(jià)十分必要。多糖類藥物結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，藥學(xué)研究評(píng)價(jià)尚有一定的難度，本文根據(jù)現(xiàn)有的研究水平，對(duì)其藥學(xué)評(píng)價(jià)進(jìn)行初步的探索。
一、提取與純化動(dòng)植物中存在的多糖或微生物胞內(nèi)多糖，因其細(xì)胞或組織外大多有脂質(zhì)包圍，要使多糖釋放出來，第一步就是去除表面脂質(zhì), 常用醇或醚回流脫脂。第二步將脫脂后的殘?jiān)运疄橹黧w的溶液提取取多糖 (即冷水，熱水，熱或冷的0.1-1.0mol/L NaOH，熱或冷的1%醋酸或1%苯酚等)，這樣提取得到的多糖提取液含有許多雜質(zhì)，主要是無機(jī)鹽，低分子量的有機(jī)物質(zhì)及高分子量的蛋白質(zhì)、木質(zhì)素等。第三步則要除去這些雜質(zhì)，對(duì)于無機(jī)鹽及低分子量的有機(jī)物質(zhì)可用透析法、離子交換樹脂或凝膠過濾法除去；對(duì)于大分子雜質(zhì)可用酶消化 (如蛋白酶．木質(zhì)素酶) ，乙醇或丙酮等溶劑沉淀法或金屬絡(luò)合物法。多糖提取液中除去蛋白質(zhì)是一個(gè)很重要的步驟，常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法, 后者較為劇烈，對(duì)于含呋喃糖殘基的多糖由于連接鍵不穩(wěn)定，所以不宜使用。但該法效率較高，操作簡(jiǎn)便，植物來源的多糖常采用該法。上述三種方法均不適合于糖肽，因?yàn)樘请囊矔?huì)像蛋白質(zhì)那樣沉淀出來。除去蛋白質(zhì)后，應(yīng)再透析一次，選用不同規(guī)格的超濾膜和透析袋進(jìn)行超濾和透析，可以將不同分子大小的多糖進(jìn)行分離和純化，該法在除去小分子物質(zhì)十分實(shí)用，同時(shí)能滿足大生產(chǎn)的需要。具有廣闊的應(yīng)用前景。 至此，得到的提取液基本上是沒有蛋白質(zhì)與小分子雜質(zhì)的多糖混合物。一般來講，通過上述方法所得到的是多糖的混合物，如果要得到單一的多糖，還必須對(duì)該混合物進(jìn)行純化。柱層析在多糖的純化較為常用，常分為兩類：一是只有分子篩作用的凝膠柱層析， 它根據(jù)多糖分子的大小和形狀不同而達(dá)到分離目的，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠，以及性能更佳的Sephacryl等。洗脫劑為各種濃度的鹽溶液及緩沖液，其離子強(qiáng)度不應(yīng)低于0.02mol/L。二是離子交換層析，它不僅根據(jù)分子量的不同，同時(shí)也具有分子篩的作用，常用的交換劑有DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖和 DEAE-瓊脂糖等，此法適合于分離各種酸性，中性多糖和粘多糖。多糖的純化還可用其他方法，如制備性高效液相層析、制備性區(qū)帶電泳，親和層析等，這些方法有時(shí)對(duì)制備一些小量純品供分析用是很有用處的。
二、 質(zhì)量研究一般來講，多糖的質(zhì)量研究主要包括各組分的理化性質(zhì)如溶解度、比旋度和粘度的測(cè)定，分子量及分子量分布的研究，平面和立體的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)構(gòu)改造和結(jié)構(gòu)修飾的研究，以及糖醛酸、蛋白質(zhì)、單糖和多糖的含量測(cè)定等等。下面簡(jiǎn)單介紹多糖的結(jié)構(gòu)、分子量及分子量分布以及含量測(cè)定等方面的研究進(jìn)展。 1、結(jié)構(gòu)分析目前在多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析中大多采用化學(xué)方法與物理方法相結(jié)合,可基本闡明某一多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)的大致特征。而目前用于多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)分析的方法主要是物理方法, 諸如 X-射線纖維衍射、核磁共振、電子衍射等。如上所述，多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)本身就很復(fù)雜。由于多糖結(jié)構(gòu)的微觀不均一性, 或結(jié)構(gòu)鍵中有缺陷, 或是分子量分散, 使多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析難以得出完全正確的結(jié)構(gòu)式。多糖結(jié)構(gòu)的描述包括:①多糖的分子量范圍；②多糖的單糖組分；③單糖的連接點(diǎn)類型；④單糖和糖苷鍵的構(gòu)型；⑤重復(fù)單位。多糖的活性與其初級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān),高級(jí)結(jié)構(gòu)在活性方面比一級(jí)結(jié)構(gòu)起更大作用。有些多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)相同, 但活性不同, 其原因是二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)不同。目前多糖的立體結(jié)構(gòu)研究一般靠 2D-NMR及X-衍射法。除此之外, 多糖的活性還與分子量、溶解度、粘度等理化性質(zhì)有關(guān)。在研究多糖的構(gòu)效關(guān)系時(shí), 常用到多糖的分子修飾, 對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)修飾,如硫酸化、脫硫酸化、化學(xué)降解、酶降解、乙酰化、烷基化等等, 有助于深入探討其構(gòu)效關(guān)系。下面將簡(jiǎn)單介紹化學(xué)方法和物理分析方法。（1）化學(xué)方法測(cè)定多糖結(jié)構(gòu)還是目前最常用的方法，測(cè)定的手段很多，其中經(jīng)典而有效的是甲基化分析、高碘酸氧化和Smith降解、部分酸水解以及乙酰解和甲醇解等。 ①甲基化分析 甲基化分析是多糖也是寡糖結(jié)構(gòu)分析的最有力的手段之一。它包括糖的所有自由羥基全部生成甲醚，接著通過水解釋放出甲基化單糖，再經(jīng)NaBH4還原成糖醇，進(jìn)而乙酰化水解后生成的羥基，得到各種部分甲基化的糖醇乙酰衍生物，生成的產(chǎn)物用氣相色譜進(jìn)行定性和定量分析，可確定組成多糖的各單糖種類和比例，進(jìn)而用氣相色譜—質(zhì)譜，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)譜圖的分析，可得到各種部分甲基化單糖衍生物的歸屬，從而確定各單糖的連接位置，即糖苷鍵的位置。但甲基化分析還無法知道異頭碳糖苷鍵構(gòu)型及多糖中單糖殘基的順序信息， 所要注意的是對(duì)含有糖醛酸或氨基己糖殘基的多糖比較難甲基化，而且有可能會(huì)產(chǎn)生二級(jí)產(chǎn)物，如糖醛酸殘基能產(chǎn)生縮酮衍生物，N-乙酰基氨基己糖殘基可產(chǎn)生N-甲基 -N-乙酰氨基己糖，對(duì)這些衍生物需要特殊分析技術(shù)才能鑒定。 ②過碘酸氧化及Smith降解 多糖的過碘酸氧化反應(yīng)通常在pH3-5的水溶液中進(jìn)行，用過碘酸鹽為氧化劑，因雙醛型的氧化產(chǎn)物在水中不穩(wěn)定，因此需要在酸水解前用NaBH4將它們還原為醇，最后，通過水解產(chǎn)物的分析結(jié)果可獲得多糖中單糖連接的類型是l→4，1→-6，1→2，還是各種連接兼而有之。 Smith降解實(shí)際上是一種改良的過碘酸氧化，它是將多糖過碘酸鹽氧化，NaBH4還原后用弱酸部分水解 (通常在室溫下用稀無機(jī)酸水解還原產(chǎn)物)，生成具有特征性的糖連接的重復(fù)單元，從而獲得更多的結(jié)構(gòu)信息。 ③部分酸水解這是多糖結(jié)構(gòu)分析中一個(gè)很有用的技術(shù)，一是通過部分酸水解可以獲得結(jié)構(gòu)較為容易測(cè)定的短鏈片段，從而集零為整推斷出多糖的結(jié)構(gòu)。二是可以在特殊糖苷鍵處斷裂，幫助整個(gè)結(jié)構(gòu)分析。如呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的單糖對(duì)酸不穩(wěn)定，用弱酸水解 (就可以得到這些殘基，再通過殘基片段的分析可得到有用的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。一個(gè)成功的例子是枸杞子糖蛋白中一條由阿拉伯糖和半乳糖組成的O—連接多糖，并從甲基化分析結(jié)構(gòu)得知，該多糖的非還原末端均為呋喃環(huán)阿拉伯糖，通過部分酸水解并用紙層析跟蹤檢測(cè)，首先釋放出Ara，到剛有Ga1釋放時(shí)終止水解，通過水解前后兩種多糖的甲基化分析結(jié)果比較，再結(jié)合其他方法測(cè)得的結(jié)果可推斷出整個(gè)多糖的可能結(jié)構(gòu)。 ④乙酰解和甲醇解 乙酰解：多糖的乙酰解反應(yīng)是在由乙酸酐、乙酸和硫酸組成的混合液中加熱進(jìn)行的，在一定的糖苷鍵處裂解。研究表明，相同糖苷鍵在酸水解和乙酰解中的速度是不同的。乙酰解是酸水解的一種有用的補(bǔ)充，多糖可從這兩種不同的方法中獲得不同的片段，從不同的角度獲得多糖的結(jié)構(gòu)信息。甲醇解：多糖在80-100℃條件下與無水甲醇氯化氫反應(yīng)能將多糖變成組成單糖的甲基糖苷，這些甲基糖苷能轉(zhuǎn)化為三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，然后進(jìn)行GC分析并與標(biāo)準(zhǔn)單糖對(duì)照，可得到組成多糖的各單糖的定量數(shù)據(jù)。（2）物理分析法 ①IR法：IR在多糖結(jié)構(gòu)分析上主要是確定吡喃糖的苷鍵構(gòu)型，以及常規(guī)觀察其他官能團(tuán)。一般主要觀察730-960cm-1的范圍，如對(duì)于α-吡喃糖，δC1-H在 845 cm-1，而β-吡喃糖，δC1-H在890cm-1有最大吸收峰。 ②MS、GC-MS：GC分析多糖雖受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，但GC-MS是多糖結(jié)構(gòu)分析不可缺少的工具，特別是對(duì)水解單糖、甲基化單糖及甲基化寡糖的分析，而且能鑒別出糖的異構(gòu)體。MS在多糖結(jié)構(gòu)分析中不僅在鑒別各種甲基衍生物的碎片，確定各種單糖殘基的連接位置時(shí)必不可少，而且由于FAB-MS、ESI-MS和 MALDI-MS等技術(shù)的出現(xiàn)，利用質(zhì)譜還可以測(cè)定多糖的分子量及一級(jí)結(jié)構(gòu)。 ③NMR：用NMR技術(shù)研究多糖結(jié)構(gòu)的一個(gè)特點(diǎn)是不破壞樣品，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)特征可通過化學(xué)位移、偶合常數(shù)、積分面積、NOE及馳豫時(shí)間等參數(shù)來表達(dá)。一維、二維圖譜 NMR在分析糖的構(gòu)型、相互連接的位置及順序等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 2、分子量及分子量分布多糖具有分子大小不均一的特點(diǎn)，近年來發(fā)現(xiàn)這些生物大分子的某一分子量范圍成分具有藥理活性，而另一分子量范圍的成分不具有藥理活性或具有一定的毒副作用，因此分子量及其分布既是這類藥物的有效性控制的指標(biāo)又是安全性控制的指標(biāo)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制訂該項(xiàng)檢查十分必要，這也是近年來大分子聚合物藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展的一個(gè)明顯的特點(diǎn)。多糖分子量只是代表相似鏈長(zhǎng)的平均配布，不同方法所測(cè)得的分子量不同，即使是同一多糖，其重均分子量與數(shù)均分子量也相差較大，通常采用凝膠色譜法控制這類藥物的分子量及其分布，應(yīng)經(jīng)研究選用與供試品分子大小相適應(yīng)的色譜柱填充劑；使用的流動(dòng)相通常為水或緩沖液，其pH值不應(yīng)超過填充劑的耐受范圍，可加入適量的有機(jī)溶劑，但濃度不應(yīng)超過30%，流速以 0.5-1.0ml/min為宜，因這類分子多無紫外吸收，一般采用示差折光檢測(cè)器，選用對(duì)照品的分子量范圍及顆粒形狀應(yīng)與供試品匹配，測(cè)定數(shù)據(jù)經(jīng)適宜的GPC軟件處理求得相關(guān)參數(shù)。 3、含量測(cè)定一般來講，多糖不含蛋白和氨基酸，蛋白或氨基酸檢測(cè)應(yīng)呈陰性或符合限度檢查要求，如為糖蛋白或糖肽，應(yīng)提供其證據(jù)，以保證產(chǎn)品不是多糖與蛋白的混合物；并提供其氨基酸構(gòu)成及蛋白含量范圍，以保證質(zhì)量穩(wěn)定可控。對(duì)從天然植物中得到的多糖, 在結(jié)構(gòu)研究中尤其對(duì)糖組成分析, 確定其中是否含有糖醛酸殘基具有很重要的意義。糖醛酸的含量測(cè)定目前較常用的是硫酸咔唑法，但容易受中性糖殘基的干擾。為了消除測(cè)定的干擾，可先測(cè)定樣品中中性糖的吸收度，然后從樣品的吸收度減去中性糖的吸收度，即為樣品中糖醛酸的吸收度值。間羥基聯(lián)苯法也是一種常用的多糖中糖醛酸含量測(cè)定方法,該法較硫酸咔唑法受中性糖殘基的干擾更小。多糖的含量測(cè)定可分為兩大類： 一類是直接測(cè)定多糖本身, 如高效液相色譜法和酶法；另一類是利用組成多糖的單糖縮合反應(yīng)而建立的方法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。前者需要多糖的純品和特定的酶，后者測(cè)定時(shí)方法學(xué)干擾較大，現(xiàn)有的比色重現(xiàn)性差，受影響因素多。但由于目前國(guó)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)條件，多糖的含量仍然主要采用這種方法，其原理為：多糖在濃硫酸水合產(chǎn)生的高溫下迅速水解，產(chǎn)生單糖，單糖在強(qiáng)酸條件下與苯酚反應(yīng)生成橙色衍生物。在波長(zhǎng)490nm左右處和一定濃度范圍內(nèi)，該衍生物的吸收值與單糖濃度呈線性關(guān)系，從而可用比色法測(cè)定其含量，所用的單糖對(duì)照品盡量采用與其多糖組成一致或?yàn)楹枯^高的單糖，這樣測(cè)得的值較準(zhǔn)確。需要強(qiáng)調(diào)的是，這種方法所測(cè)定的是總糖的含量而不是總多糖的含量，因此首先應(yīng)測(cè)定樣品中游離的單糖含量，然后將總糖的含量減去游離單糖的含量，即為總多糖的含量。另外還可以采用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法），它是在堿性條件下顯色，較準(zhǔn)確測(cè)定還原糖與總糖的含量從而求出多糖的含量，可消除還原性雜質(zhì)的干擾。
三、結(jié)語(yǔ)近20年來, 由于生物學(xué)、化學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展,人們對(duì)多糖及其復(fù)合物的活性作用有了越來越深入的認(rèn)識(shí)，但是多糖本身尚還有許多問題有待于進(jìn)一步研究解決，如有的多糖類物質(zhì)在天然產(chǎn)物中含量很低，提取分離困難，有的多糖類質(zhì)量不容易控制，特別是菌類植物經(jīng)發(fā)酵后提取分離得到的多糖。而多糖類結(jié)構(gòu)測(cè)定有著自身的難度和特殊性，當(dāng)前的研究層次和水平仍較落后。所以，申報(bào)單位在多糖類新藥的研發(fā)中有必要進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究。
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